名稱 | 質(zhì)控菌 |
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG） | 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌 |
酪胨瓊脂（GA） | 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 |
葡萄糖蛋白胨（GP） | 白色念珠球菌、黑曲霉菌 |
- 材料：
名稱 | 廠家 | 批號 | 名稱 | 批號 | 活菌數(shù) | 規(guī)格 | |
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG） | 中海生物 | 150420 | 金黃色葡萄球菌 | 自制 | 201301 | 9.5*105CFU/ml | 0.5ml/支 |
酪胨瓊脂（GA） | 中海生物 | 151123 | 銅綠假單胞菌 | 自制 | 201301 | 8*106 CFU/ml | 0.5ml/支 |
葡萄糖蛋白胨（GP） | 中海生物 | 151026 | 白色念珠球菌 | 自制 | 201301 | 1.6*104 CFU/ml | 0.5ml/支 |
蛋白胨 | OXO | 869398 | 生孢梭菌 | 自制 | 201301 | 8*104 CFU/ml | 0.5ml/支 |
營養(yǎng)瓊脂 | 中海生物 | 160229 | / | / | / | / | / |
- /主要試劑配方
3.1 硫乙醇酸鹽（TG）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基30g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。
3.2 酪胨瓊脂（GA）培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基42g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。
3.3葡萄糖蛋白胨（GP)培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基28g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。
3.4 半固體TG培養(yǎng)基：分別取TG培養(yǎng)基30g、GA培養(yǎng)基1g，加入1L MILLIPORE水，加熱煮沸至完全溶解分裝，116℃高壓滅菌30min，于室溫備用。
3.5 0.1%蛋白胨水：取1g胰蛋白胨，加入100ml MILLIPORE水，溶解后121℃ 滅菌15min，放置室溫后，置2-8℃保存。
- 實驗方法
4.1 GA/TG培養(yǎng)基最小檢出量實驗
將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表3進(jìn)行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml、15CFU/0.2ml、20CFU/0.2ml得稀釋度,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌每個稀釋度分別接種TG、 6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄；金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種GA斜面6支，每支0.2ml,3支置25℃培養(yǎng)箱，另3支置37℃培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)7日，每天觀察小管污染情況并記錄。
同時金黃色葡萄球菌每個稀釋度接種2副營養(yǎng)瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。
銅綠假單胞菌每個稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。置37℃培養(yǎng)。
生孢梭菌每個稀釋度接種2管半固體TG培養(yǎng)基，每管0.2ml菌液,置37℃培養(yǎng)。
TG/GA小管配制日期：2016.03.21
接種日期：2016.03.23
表3 銅綠假單胞菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌最小檢出量驗證稀釋方法
銅綠假單胞菌 | 管號 | 原瓶 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | 10 | 11 |
稀釋液ml | 1ml | 4.5 | 9 | 9 | 9 | 9 | 7.4 | 6 | 7 | 5 | 6 | ||
加樣量 | / | 取原瓶0.5 | 取①1 | 取②1 | 取③1 | 取④1 | 取⑤4 | 取④2 | 取⑤ | 取④1 | 取⑤2.5 | 取⑥1 | |
CFU/ml | 4*106 | 4*105 | 4*104 | 4*103 | 400（計數(shù)） | 75（計數(shù)） | 35（計數(shù)） | 100 | 75 | 50 | 25 | 5 | |
CFU/0.2ml | / | / | / | / | / | / | / | 20 | 15 | 10 | 5 | 1 | |
生孢梭菌 | 管號 | 原瓶 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | / | / |
稀釋液ml | 1ml | 4.5 | 9 | 9 | 9 | 3 | 4.3 | 7 | 2.4 | 4 | / | / | |
加樣量 | / | 取原瓶0.5 | 取①1 | 取②1 | 取③1 | 取②1 | 取②1 | 取②1 | 取③4 | 取⑧1 | / | / | |
CFU/ml | 4*104 | 4*103 | 400 | 40 | 4 | 100 | 75 | 50 | 25 | 5 | / | / | |
CFU/0.2ml | / | / | / | / | / | 20 | 16 | 10 | 5 | 1 | / | / | |
金黃色葡萄球菌 | 管號 | 原瓶 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | / | / |
稀釋液ml | 1ml | 4.5 | 4.5 | 4.5 | 3.75 | 5.2 | 4.25 | 4.25 | 2 | 4.5 | / | / | |
加樣量 | / | 取原瓶0.5 | 取①0.5 | 取②0.5 | 取③1 | 取③1 | 取③0.5 | 取③0.5 | 取⑦2 | 取⑦0.5 | / | / | |
CFU/ml | 4.75*105 | 4.75*104 | 4.75*103 | 4.75*102 | 100 | 75 | 50 | 50 | 25 | 5 | / | / | |
CFU/0.2ml | / | / | / | / | 20 | 15 | 10 | 10 | 5 | 1 | / | / |
4.2 GP培養(yǎng)基最小檢出量實驗
將白色念珠球菌用0.1%蛋白胨水還原后，分別按照表4進(jìn)行稀釋，取理論菌落數(shù)為1CFU/0.2ml、2CFU/0.2ml、4CFU/0.2ml、5CFU/0.2ml、10CFU/0.2ml得稀釋度，每個稀釋度分別接種GP斜面 3支，每支0.2ml置25℃培養(yǎng)箱，每天觀察小管污染情況并記錄。同時每個稀釋度接種2副酪胨瓊脂平皿，每副平皿加0.2ml菌液。
GP小管配制時間：2016.04.08
檢驗日期：2016.04.09—2016.04.16
表4 白色念珠菌最小檢出量驗證稀釋方法
白色念珠菌 | 管號 | 原瓶 | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ |
稀釋液ml | 1ml | 4.5 | 9 | 4.5 | 4.4 | 3 | 7 | 1.8 | 1.8 | |
加樣量 | / | 取原瓶0.5 | 取①1 | 取②0.5 | 取②2 | 取②1 | 取②1 | 取③3 | 取②3 | |
CFU/ml | 8000 | 800 | 80 | 8 | 25 | 20 | 10 | 5 | 50 | |
CFU/0.2ml | / | / | / | / | 5 | 4 | 2 | 1 | 10 | |
接種管號 | / | / | / | / | √ | √ | √ | √ | √ |
- 實驗結(jié)果
5.1 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基最小檢出量得實驗結(jié)果
按照4.1得實驗方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見表5、表6、表7。
表5 金黃色葡萄球菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量
時間 | 最終接種菌數(shù)（CFU） | |||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | ||||||
37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | |
第1天（+） | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 |
第2天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第3天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第4天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第5天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第6天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第7天（+） | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
培養(yǎng)結(jié)果 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | |||||
計數(shù)菌數(shù)（CFU) | 1,0 | 3,4 | 12.18 | 16.16 | 20,22 | |||||
表6銅綠假單胞菌和生孢梭菌在流乙醇酸鹽培養(yǎng)基中得最小檢出量
時間 | 生孢梭菌最終接種菌數(shù)（CFU） | 銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU） | ||||||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 1 | 5 | 10 | 15 | 20 | |||||||||||
37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | |
第1天（+） | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 1/3 | 0/3 | 2/3 | 0/3 | 3/3 | 1/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 |
第2天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第3天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第4天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第5天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第6天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第7天（+） | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
培養(yǎng)結(jié)果 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||||||||||
計數(shù)菌數(shù)（CFU) | 2,2 | 9，10 | 26,24 | 29 | 37 | 0,0 | 0,0 | 6,4 | 2,2 | 4,8 | ||||||||||
結(jié)果表明：硫乙醇酸鹽對金黃色葡萄球菌得最小檢出量為3CFU、對生孢梭菌最小檢出量為2CFU、對銅綠假單胞菌得最小檢出量為2CFU。
備注：理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)有一定差異，結(jié)論以實際計數(shù)結(jié)果為準(zhǔn)。
銅綠假單胞菌實際結(jié)果與計數(shù)結(jié)果差異較大，2次重復(fù)試驗均如此。
5.2 酪胨瓊脂培養(yǎng)基最小檢出量得實驗結(jié)果
按照4.1得實驗方法，確定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見表7。
表7 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量
時間 | 金黃色葡萄球菌最終接種菌數(shù)（CFU） | 銅綠假單胞菌最終接種菌數(shù)（CFU） | ||||||||||||||||||
1 | 5 | 10 | 15 | 20 | 1 | 5 | 10 | 15 | 20 | |||||||||||
37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | 37℃ | 25℃ | |
第1天（+） | 0/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 | 3/3 | 0/3 |
第2天（+） | 2/3 | 1/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 0/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第3天（+） | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 0/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第4天（+） | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 0/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第5天（+） | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第6天（+） | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
第7天（+） | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 1/3 | 3/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 |
培養(yǎng)結(jié)果 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 1/3 | 2/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||||||||||
計數(shù)菌數(shù)（CFU) | 1,0 | 3,4 | 12.18 | 16.16 | 1,0 | 0,0 | 0,0 | 6,4 | 2,2 | 4,8 | ||||||||||
結(jié)果表明：酪胨瓊脂培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌得最小檢出量為3CFU、對銅綠假單胞菌得最小檢出量為2CFU。
5.3 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基最小檢出量實驗結(jié)果
按照4.2得實驗方法，確定白色念珠球菌在酪胨瓊脂培養(yǎng)基中得最小檢出量，結(jié)果見表8。
表8 白色念珠菌在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中得最小檢出量
時間 | 白色念珠菌最終接種菌數(shù)（CFU） | ||||||
1 | 2 | 4 | 5 | 10 | |||
25℃ | 25℃ | 25℃ | 25℃ | 25℃ | |||
第1天（+） | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | ||
第2天（+） | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | ||
第3天（+） | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
第4天（+） | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
第5天（+） | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
第6天（+） | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
第7天（+） | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
觀察結(jié)果 | 1/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | 3/3 | ||
計數(shù)菌數(shù)（CFU) | 0，0 | 0，0 | 1，0 | 1，1 | 3，3 | ||
結(jié)果表明：葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基對白色念珠球菌得最小檢出量為1CFU。
- 結(jié)論與分析
1.理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)差異問題 根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，理論接種菌落數(shù)與同步計數(shù)菌落數(shù)有一定差異，其中以銅綠假單胞菌差異蕞大。目前還未找到原因。因為同步計數(shù)菌落數(shù)比理論菌落數(shù)更加接近實際得菌落數(shù)，因此最小檢出量以同步計數(shù)菌落數(shù)來計算。
2.最小檢出量得管數(shù)判定問題 在實驗過程中，每個稀釋度均接種3個對應(yīng)得培養(yǎng)基小管，在培養(yǎng)結(jié)束后判定實驗結(jié)果時，是按照3/3全部污染為標(biāo)準(zhǔn)。可是菌落數(shù)較少得稀釋度并不是均不污染，而是污染2/3、1/3管。根據(jù)此現(xiàn)象，推測是因為細(xì)菌在樣品中數(shù)量太少，而接種時只吸取0.2ml接種，若0.2ml里有菌落，則能夠檢出；若0.2ml里剛好沒有吸到菌落則檢不出來。因此，若認(rèn)為每次接種均能夠吸取菌落，則按照實驗結(jié)果，則每一種培養(yǎng)基得最小檢出量均為1個CFU。
名稱 | 質(zhì)控菌 | 3/3管最小檢出量 | 2/3管最小檢出量 | 1/3管最小檢出量 |
流乙醇酸鹽培養(yǎng)基（TG） | 金黃色葡萄球菌 | 3CFU | / | 1CFU |
銅綠假單胞菌 | 2CFU | 1CFU | 1CFU | |
生孢梭菌 | 2CFU | / | / | |
酪胨瓊脂（GA） | 金黃色葡萄球菌 | 3CFU | / | 1CFU |
銅綠假單胞菌 | 2CFU | 1CFU | 1CFU | |
葡萄糖蛋白胨（GP） | 白色念珠球菌 | 1CFU | 1CFU | 1CFU |
3.增大無菌檢驗檢出率得措施
根據(jù)以上實驗結(jié)果和分析，在無菌檢驗過程中因取樣量得原因確實會出現(xiàn)漏檢得機率，可以加大接種量（小管接種從0.2ml加大到0.5ml，小瓶從1ml加大到5ml）避免漏檢。對于半成品檢驗來說，二檢抗原制定合理得取樣接種時間也十分重要。
